腫瘤細胞體外傳代培養及保種

一. 細胞復蘇與培養

將液氮或- 80℃ 保存的腫瘤細胞于 37℃ 水浴，快速溶化，用 8.0ml 培養基混勻已融化的腫瘤細胞懸液，于 1500 轉/ 分，離心 3 分鐘。 棄上清，再吸取 8.0ml 培養基質混勻細胞沉淀，再 1500 轉/ 分，離心 3 分鐘，棄上清，細胞沉淀用 1.0ml 培養基混勻，備用。 另取一個 75cm2 方瓶，加入 14.0ml 培養基質，將上述制備的含 腫瘤細胞懸液(1.0ml)加入此方瓶中，于 37℃，5%CO2 孵育箱中培養。

若此腫瘤細胞懸浮生長，大約 3－4 天細胞基質會變黃，5.0ml 細胞懸液可傳代一個方瓶培養，可用 3－4 個方瓶培養，一個方瓶中呈對數生長的腫瘤細胞可達 1-1.5×107 個，根據試驗所需，可決定傳代的次數。 若此腫瘤細胞呈貼壁生 長，經過 3-4 天，腫瘤細胞生長至 80%-95% 單層時，棄上清，用 0.5mM 的EDTA(難消化的腫瘤細胞用0.25%*1.0ml)，處理腫瘤細胞大約 3-5 分鐘，用倒置顯微鏡觀察，當 90% 的腫瘤細胞變圓時，即可用彎管吹打并將消化的細胞轉移到 15ml 離心管中，于 1500 轉/ 分下，離心 3 分鐘，棄上清，加少許培養基混勻，可傳代 3 個 75cm2 方瓶擴大培養。

二. 細胞凍存

將對數生長的腫瘤細胞用 1 個 75cm2  方瓶按上述方法收集，于 1500 轉/分離心 3 分鐘，棄上清，用保種液( 含 10% DMSO 的小牛血清)3.0ml 混勻，分別加入到 2-3 只保種管中，寫上腫瘤細胞名稱、時間、保種者姓名，放- 80℃ 保存，次日將它們轉移到液氮中保存( 注： -80℃  下可保存細胞半年至一年，液氮可保存細 胞 5-10 年，甚至更長的時間)。以上所有物品均需經過高溫滅菌 ( 121℃，30 分鐘) ，培養基質則經過過濾(0.22uM)除菌，所有操作均必須遵守無菌操作技術，避免細菌、真菌、病原體、衣原體等污染。