ELISA試驗中常出現問題及解決辦法

ELISA方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定。除了盒子本身質量外，操作中很多因素都影響試驗的正常結果。zui常出現的問題是顯色淡，靈敏度偏低、重復性不佳、假陽性結果和假陰性結果，不管出現什么樣的結果，不但浪費客戶的金錢、樣本、精力，更重要的是對臨床做出了危險判斷。在這里我們分析ELISA試驗非正常檢測結果產生的常見原因，并探討其解決辦法，以提高檢測質量。

一、顯色淡，靈敏度偏低

1、試劑盒在運輸途中時間太長，溫度太高；所以盡量縮短運輸時間，夏季應放冰塊降溫

2、試劑盒未充分平衡；所以試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）。

3、培養箱溫度不足37℃，應注意培養箱溫度，放入反應板后盡量減少開啟次數以免影響溫度恒定，非隔水式培養箱尤其應注意。

4、保溫時間不足；所以做實驗時一定注意時間的重要性，如果怕忘了時間，可以校正定時鐘準確定時。

5、洗滌時沖擊力太大、浸泡時間過長、洗滌次數增加；按說明書要求保留洗滌時間，準確記住洗滌次數

6、移液器吸液量不足，吸嘴內壁掛水太多或內壁不清潔；所以保證校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時要緊密，吸嘴內壁要清潔，一次性使用。

7、蒸餾水水質有問題，要使用新鮮合格的蒸餾水。

二、重復性較差，經常有客戶反饋說做了兩個復孔值相差太大。可能的問題有：

 1、樣品數量多少不一，加樣時間有長有短；所以重復某一樣品時，加樣時間盡可能與*次接近。

 2、保溫時間不一致，洗滌條件不一致，操作人員不一致；重復測定標本，操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性。

 3、加樣量不一致；樣品稀釋前應充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴。

三、假陽性結果和假陰性結果

1、標本的采集與保存

1.1當標本采集保存不當產生溶血時，紅細胞中的血紅蛋白釋放到血清中，血紅蛋白具有過氧化物酶的性質，其通過吸附或“PP效應”（蛋白質間相互吸附的現象）結合后，可催化A、B液顯色而造成假陽性

1.2標本采集保存不當致細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，會產生假陽性反應；標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG聚合，易使間接法的試驗本底加深。因此，標本宜在新鮮時檢測。

1.3反復凍融血清會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存做多次檢測，宜少量分裝凍存。

2、加樣

2.1如果 樣品稀釋液少加或血清多加，都會引起本底增高。對于間接法來說，受上述兩個因素影響更大。因為血清中受檢的特異性IgG只占IgG的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異性IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異性的IgG均可以和酶標二抗發生反應而造成較高陰性本底或假陽性。如果加入的血清過多，高于規定的稀釋倍數，極易造成高值陰性。反之，造成假陰性。

2.2  如果加入的酶結合物過多或加在較高的孔壁上或孔口，也會引起本底升高或假陽性。

2.3如果血液未開始凝固或凝固不*時就強行離心分離血清，此時的血清中仍留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結果。

3.  溫育

3.1  由于ELISA試驗在一定溫度下的反應時間并不是反應的終點，溫育時間過短、溫度過低，易致顯色不全；溫育時間過長、溫度過高，易致非特異性結合緊附于反應孔周圍，難以清洗*，產生陰性高值或假陽性反應。因此，要嚴格按規定的溫度和溫育時間進行。

3.2  由于水浴較難將溫度控制在穩定的范圍，因此我們每次試驗時應認真觀察水浴箱的溫度，盡量少開啟水浴箱門，嚴格控制水浴的溫度為37±0.5。同時，微孔板不可重疊放置，以保證傳熱均勻，各板的溫度都能迅速達到平衡。

3.3  由于試劑盒通常設定的反應溫度為37度，在這個溫度下溫育一定時間，蒸發的水分會很多，對于整個反應體系來講，各種反應物的濃度會不斷地增加，這樣必會導致反應zui后的值升高。因此溫育時應貼上封板膠。

4.  洗板

    洗板在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻是決定試驗成敗的關鍵。ELISA就是靠洗板來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的，通過洗板以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗板時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。在ELISA操作中，洗滌是zui主要的關鍵技術，應嚴格按要求洗滌。洗板如不*，有酶結合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標本內的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標記抗體作用而產生干擾。

4.1  各廠家的洗液是根據各自試劑的條件配制的，因此采用不配套的洗液常會得到不正常的反應結果，包括本底升高，所以不同廠家的洗液不應混用。

4.2  洗液應按規定的倍數稀釋使用。試劑盒提供的洗液是濃縮的，過多稀釋洗液，會影響洗液的效果，而使反應的本底升高。反之造成假陰性。

4.3  稀釋洗液的水應該是新鮮的蒸餾水，電導率小于1.5us/cm。如果水中含有過多的鈣、鎂離子，這些離子會占用表面活性劑，使試驗本底增高。