細胞凋亡檢測操作流程3

凋亡檢測操作流程

三、JC-1檢測凋亡細胞線粒體膜電位改變


BD™ MitoScreen (JC-1)線粒體膜電位檢測試劑盒（551302）： 

組分 描述
JC-1(染料) 4瓶，每瓶用于25個樣本。凍干粉，使用前稀釋至儲存液（Stock Solution），使用時稀釋至工作液（Working Solution）
10 x Assay Buffer 60ml，足以用于100個樣本。使用前稀釋至1X

試劑準備： 

A.10× Assay Buffer的稀釋（Assay Buffer作為實驗的反應液用于清洗細胞） ： 
    a) 使用前將10× Assay Buffer置于37°C水浴箱中至溶解。
    b) 用雙蒸水1：10稀釋10× Assay Buffer，攪拌5分鐘。
    c) 使用前將1× Assay Buffer 在37°C預熱。

JC-1儲存液的配制（一瓶）： 

    a) 室溫下每瓶用125μl DMSO 稀釋JC-1凍干粉。反復倒置混勻小瓶使JC-1充分溶解。 
    b) 儲存液應立即稀釋為工作液或分裝成小份（避光操作），-20°C保存（可長達6個月）。
    c) 避免反復凍融JC-1儲存液。 


JC-1工作液的配制：
      a) 37°C預熱1× Assay Buffer。
      b) 用1× Assay Buffer 1：100稀釋 JC-1儲存液至JC-1工作液。例如將125μl的JC-1儲存液加入 12.375ml 預熱的1× Assay Buffer中。 實驗操作時，每個樣本（<106細胞）需要0.5ml的JC-1工 作液。
      c) 輕柔混勻JC-1工作液待用。（混勻后可能會出現少許JC-1聚集微粒，但并不影響流式檢測。也可在室溫13,000g離心3分鐘或 1，000g 離心15分鐘去除JC-1團絮。）

  實驗操作：

制備1x106 /ml的細胞懸液， 濃度不宜過高，因為超過該濃度容易造成細胞的凋亡。
誘導細胞進行凋亡的處理，同時保留一份未經誘導的細胞作為對照。
凋亡處理結束后，每個無菌的15ml聚苯乙烯離心管中加入1ml細胞懸液，室溫下，400×g ，離心5分 鐘，棄上清。 
每管加入0.5 ml 新鮮配制的JC-1工作液，充分混勻后置于37°C的CO2培養箱，孵育10-15分鐘。
按以下步驟洗滌細胞兩次：
  *次：每管加體積為2 ml的 1× Assay Buffer，輕輕懸浮細胞，振蕩或用槍頭使細胞分散，以免細 胞聚集成塊。400×g ，室溫離心5分鐘，棄上清。 
  第二次：每管加體積為1ml的 1× Assay Buffer，輕輕懸浮細胞，振蕩或用槍頭使細胞分散，以免細 胞聚集成塊。400×g ，室溫離心5分鐘，棄上清。 
每管加體積為0.5 ml的 1× Assay Buffer，輕輕懸浮細胞，上機檢測。