熒光定量PCR技術及其應用

熒光定量PCR（也稱TaqMan PCR,以下簡稱FQ-PCR）是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術，該技術是在常規PCR基礎上加入熒光標記探針來實現其定量功能的，與變通PCR相比，FQ- PCR具有許多優點。本文擬就該技術的特點、原理和方法以及應用作一簡要敘述。 
1 特點 
FQ-PCR不僅具有普通PCR的高靈敏性，而且由于熒光探針的應用，可以通過光電傳導系統直接探測PCR擴增過程中熒光信號的變化以獲得定量結果，所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術的高性，克服了常規PCR的許多缺點。如一般PCR產物都需通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色紫外光觀察結果或通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測，不僅需要多種儀器，而且費時費力，所使用的染色劑溴化乙錠對人體又有害，這些繁雜的實驗過程又給污染和假陽性提供了機會。而FQ-PCR只須在加樣時打開一次蓋子，其后的過程*是閉管操作，不需要PCR后處理，避免了常規PCR操作中的諸多弊端。實驗一般使用PE公司研制的ABI7100型PCR擴增儀。該儀器具有以下特點：①應用廣泛：可用于DNA和RNA的PCR產物定量、基因表達研究、病原體檢測及PCR條件的優化等。②*的定量原理：采用熒光標記探針，經激光激發后熒光量隨PCR循環而累積，從而達到定量目的。③工作效率高：內置9600型PCR擴增儀，電腦控制1～2小時全自動同步完成96個樣品的擴增及定量。④無須凝膠電泳：無須對樣品進行稀釋和電泳，只須通過特殊探頭在反應管內直接檢測。⑤無管道內污染：采用*全封閉反應管及光電傳導系統，無須顧及污染。⑥結果重現性好：定量動態范圍高達五個數量級。所以自從此項技術研制成功以來，受到許多科研工作者的重視并在多個領域得到應用。 
 
2 原理和方法 
FQ- PCR的工作原理[1～4]是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反應系統中加入一個熒光標記探針。該探針可與引物包含序列內的DNA模板發生特異性雜交，探針的5’端標以熒光發射基因FAM（6-羧基熒光素，熒光發射峰值在518nm處），靠近3’端標以熒光淬滅基團TAMRA（6-羧基四甲基若丹明，熒光發射峰值在582nm處），探針的3’開端被磷酸化以防止探針在PCR擴增過程中被延伸。當探針保持完整時，淬滅基團抑制發射基團的熒光發射。發射基團一旦與淬滅基團發生分離，抑制作用被解除，518nm處的光密度增加而被熒光探測系統檢測到。復性期探針與模板DNA發生雜交，延伸期Taq 酶隨引物延伸沿DNA模板移動，當移動到探針切斷，淬滅作用被解除，熒光信號釋放出來（見圖）。模板每復制一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團數目和PCR產物數量是一對一的關系，因此用該技術可對模板進行準確定量。實驗儀器一般使用PE公司研制的ABI7100型 PCR擴增儀，也可用其它PCR儀。如果用ABI7700型反應型反應系統進行實驗，反應結束后，通過電腦分析，可直接給出定量結果。如果用其他PCR 儀，則需要同時使用熒光探測儀測量反應管中的熒光信號，計算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表樣品管熒光發射基團發光強度與淬滅基團發光強度的比率，RQ-代表空白管中二者的比率，△RQ（△RQ=RQ+-RQ-）代表PCR過程中熒光信號變化量，經過數據處理，即可得出定量結果。由于熒光探針的引入，顯著提高了實驗的特異性。探針設計一般應符合以下條件[2]：①探針長度應在20～40個堿基左右，以保證結合的特異性。②GC堿基含量在 40%～60%，避免單核苷酸序列的重復。③避免與引物發生雜交或重疊。④探針與模板結合的穩定程度要大于引物與模板結合的穩定程度，因此探針的Tm值要比引物的 
Tm值至少高出5℃。另外，探針的濃度、探針與模板序列的同源性，探針與引物的距離都對實驗結果有影響。 
 
圖.TaqMan PCR反應模式 （A）聚合反應；（B）鏈置換；（C）裂解； （D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA，FP：上游引物；RP：下游引物）
圖.TaqMan PCR反應模式 （A）聚合反應；（B）鏈置換；（C）裂解； （D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA，FP：上游引物；RP：下游引物）
 
3 應用 
由于FQ-PCR具有高靈敏性，高特異性和高性的特點，目前，該項技術已被應用于病原體測定、腫瘤基因檢測、免疫分析、基因表達、突變及其多態性的研究等多個領域。 
 
3.1 病原體測定 
由于PCR技術的問世，使得病原體檢測能夠快速而方便的進行。但由于其高靈敏性，實驗操作很容易受到污染而出現假陽性。只要有微量病原體存在，PCR擴增即可為陽性結果，但并不能作為診斷依據，只有當一定數量的病原體存在時才有臨床意義，因此結模板定量顯得特別重要。常規PCR由于不能定量而限制了其應用，然而，PE公司研制的FQ-PCR技術給解決這一問題提供了可能。目前該技術已經應用于丙肝病毒、人類瘤病毒、結核桿菌和食品中大腸桿菌等許多病原體的檢測研究。 Morris等[3]用FQ-PCR對黑猩猩丙型肝炎動物模型和臨床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）進行了研究。測定顯示，可測得的樣品濃度相當于每毫升13個基因組。與巢式PCR比較顯示，FQ-PCR有著與巢式PCR相同的敏感性。另外，還對48例臨床丙型肝炎病人血清樣品進行了測試，32例樣品兩種檢測方法均為陽性，10例均為陰性；另有6例用兩種方法測定的結果不一致。該6例樣品又讓第三個實驗室用巢式PCR方法重新測定，其結果與FQ-PCR測定的結果一致率為*。FQ-PCR技術在保持巢式PCR高度敏感性的同時又能提率，因此可作為一種檢測HCV的有效方法。同時，由于FQ-PCR可以測出血清中病原體濃度，故可給藥物治療及療效觀察提供參考依據。 
與及其癌前病變有關的人類瘤病毒（HPV）有多種類型，以HPV-16、18、31、33、35等類型危險性zui高。Swan等[4]1997年用FQ-PCR技術對子宮灌洗標本進行了研究。 
他們發現，由于熒光探針的應用，對各型HPV的檢測變得十分方便和準確。由于HPV-16的特異引物可以和HPV-66的模板DNA發生錯配，用一般PCR 方法擴增時，如有HPV-66存在，即可擴增出HPV-66片段而發生誤診，但是HPV-16特異探針的應用使HPV-66在TaqMan系統中不能擴增。因此，FQ-PCR對不同亞型的病毒檢測具有高度特異性。同時也發現FQ-PCR具有高度敏感性，用一般PCR方法檢測不到的HPV模板濃度在 TaqMan系統中卻可檢測到。對于HPV-16、18、31、33、35類型敏感高達到每100～1000個細胞中含有一個拷貝的HPV基因組，平均每 300個細胞中含有一個拷貝的HPV基因組。 
以前常規檢測大腸桿菌的方法，都是采用多種選擇性培養基培養分離法，對產志賀氏毒素的大腸桿菌（SLTEC）缺乏特異性，因此這種菌株的檢測又費時又困難。后來又有應用抗體的免疫學方法和核酸序列測定的生化方法及以DNA擴增為基礎的PCR方法等，都因為繁瑣，需要大量的PCR后處理過程及不能對標本定量而受到限制。美國Witham等[5]1996年將FQ-PCR技術應用于牛肉中大腸桿菌志賀氏毒素基因的檢測研究。針對不同血清變異型的大腸桿菌，他們設計應用不同的探針，從而提高了實驗特異性。他們同時還對探針相對于引物的位置、反應液中探針濃度、鎂離子濃度等影響實驗的因素進行了優化實驗，以提高實驗的準確性和性。由于TaqMan系統可以一次測量96管樣品，還可對模板進行準確定量，又不需要進行電滬及EB染色后處理過程，實際應用方便，從而提高了實驗的參考價值和應用價值。因此該實驗方法是食品檢測方面的一個突破。此外，加拿大Chen等[6]1997年也把FQ-PCR技術用于食品中沙門氏桿菌的檢測研究。 
在抗癆治療開始后，結核病人痰中可持續存在有結核桿菌，為了研究結核病人痰標本DNA定量結果是否與有活力的結核桿菌數量相符合并監測治療反應，1998年美國Desardin等[7]用FQ-PCR和競爭性PCR兩種方法定量檢測治療期間連續收集的結核病人痰標本，結果顯示兩種方法有較好的重復性和準確性。痰中結核桿菌DNA定量結果與抗酸染色顯微鏡下計數的結果一致。 
 
3.2腫瘤研究 
意大利Gelmini等 [2]用FQ-PCR技術檢測癌標本c-erbB-2基因拷貝數目變異情況。他們以β-肌動蛋白基因為參照探索實驗條件，當擴增循環數在 28～31之間時，△RQ與模板DNA有著較好的劑量依賴關系。他們在此條件下擴增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因，發現△RQ都與各自的模板 DNA濃度存在著線性關系，雖然二者斜率不同，但是各個實驗濃度下二者的△RQ之比卻是恒定的。說明盡管二者發光效率不同，卻不影響定量效果。為了檢驗 FQ-PCR的準確性和對不同基因拷貝數的分辨率，他們將c-erbB-2基因的DNA樣本用正常胎盤DNA做不同倍數稀釋后進行實驗，測得的結果與期望值高度相關（r=0.997）。他們將實驗數據與Southern印跡結果和已報告的競爭性PCR結果比較都顯示高度相關性（n=25，r=0.94，P <0.01）。 
1998年法國Bieche等[8]用FQ-PCR測定了108例癌標本。他們選擇擴增頻率較高的myc、ccnd1和 erbB2基因進行擴增，在108例標本中，發現10%的myc基因、23%的ccnd1基因和15%的erbB2基因都有不同程度拷貝數增加，拷貝數增加的zui大值分別為4.6、18.6、15.1。同時他們又將這些數據與Southern印跡的結果進行比較，顯示了較好的相關性。 
 
3.3基因表達研究 
由于TaqMan系統及熒光探針的應用，對mRNA的檢測顯得較以前常用的方法如Northern印跡、RT-PCR定量法要方便、快速、準確得多。為了探測骨髓基質血小板生成因子（TPO）在巨核細胞生成過程中的作用以及血小板生成因子在特發性血小板減少性紫瘢（ITP）、再生障礙性貧血（AA）和特發性血小板多癥（ET）等疾病過程中的病理生理意義，日本Hirayama等[9]用TaqMan EZ RT-PCR試劑盒在ABI7700反應系統測定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基質細胞TPO mRNA水平，又用ELISA方法測定了骨髓和末梢血的TPO濃度。結果顯示ITP和AA病人TPO mRNA水平明顯升高，而ET病人的TPO mRNA水平則正常，經類固醇治療后ITP病人TPO mRNA水平下降；骨髓TPO的濃度與其 mRNA水平有相關性；在正常人和ITP病人，TPO mRNA表達水平與巨核細胞計數也有相關性。這個實驗對闡明TPO 的作用提供了依據。日本Shimokawa等[10]也用FQ-PCR技術對鼠成肌細胞系C2C12中肌肉調節因子的表達水平及動態變化進行了研究。 
 
3.4免疫組份分析 
對免疫T細胞群體V-β組份進行分析是研究健康和疾病免疫應答反應的重要手段，可通過流式細胞法或RFQ-PCR法來進行[11，12]。流式細胞法是通過對細胞群體進行直接而方便的V-β表達方面的研究，但需要一整套單克隆抗體和大量細胞來進行染色分析，而且人類V-β特異性抗體尚不完備，因此該方法有許多不便之處。如果用FQ-PCR方法，即不需要大量細胞，引物設計也很方便，而且已有多種定量方法，包括錨式PCR法、半定量PCR法、競爭性PCR法等[13，14]，但都因PCR產物的后處理過程需凝膠電泳、EB染色和光密度測量等既費時，又降低了準確性，還增加了污染機會，使得FQ-PCR的應用受到限制。1997年Lang等[15]用FQ-PCR技術進行實驗，從而避免了這些問題，他們在反應系統中引入熒光探針，將下游引物與探針固定，然后，針對不同的V-β成份，選用特異的上游引物進行擴增，再對反應中產生的熒光信號進行處理，即可獲得各個成份的數據。 
 
3.5基因突變及多態性的研究 
美國Ibrahim等[16]1997用FQ-PCR技術對正常痘病毒多態性進行了研究。他們采用一對可與正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段結合的引物，并設計兩個有單核苷酸差異的寡核苷酸探針，用熒光標記后進行實驗，順利地把有此單核苷酸差異的兩個痘病毒株進行鑒定。該技術也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的單核苷酸變異多態的研究。 
 
3.6其他方面 
日本Iso7]利用FQ-PCR進行葉綠體成熟度與其基因組拷貝數關系的研究。他們以核基因Cab作為內參照，進行葉綠體基因rbc1拷貝數測定，結果發現子葉出現以后，葉綠體基因拷貝數顯著增加，進而把葉綠體的基因拷貝數增加與光誘導的葉綠體成熟過程起來。1998年美國Higgins等[18]還建立起一套用熒光探針檢測鼠疫纖溶酶原激活基因（pla）的實驗方法。 
 
4 結語 
綜上所述，FQ-PCR作為一種核酸定量技術，應用較多且較成熟的主要是在病原體檢測方面，其*性在此方面也得以充分體現。因此將該項技術進一步開發應用于臨床，具有很大潛力。但是在遺傳病和腫瘤研究方面，尤其是基因表達的研究，該技術目前應用的還較少，在此方面加強研究應用，將會有廣闊的前景。