免疫沉淀操作詳細(xì)步驟

 1．主要內(nèi)容
    確定抗原的存在、質(zhì)量、大小、轉(zhuǎn)換、修飾及相關(guān)性。
    多個(gè)步驟共需1/2—1天。
    半定量到定量。
    敏感性取決于抗原的相對(duì)質(zhì)量及抗體的親和力。
需要高親和力的抗體。
 
    2．操作步驟
    (1)每1．0ml抗原溶液中加入50pl正常兔血清。
    (2)冰上孵育1h。
    (3)在孵育的同時(shí)，另將SAC在裂解緩沖液中清洗1次。每50u1正常兔血清使用100,ul包裝好的SAC。以10 000g，30s離心SAC，用巴斯德移液管研磨使SAC再懸浮。10000g再次離心，移去洗液，將洗好的SAC微球置于冰上。
    (4)孵育1 h后，用裂解產(chǎn)物再懸浮SAC微球。
    (5)冰上孵育30min。
    (6)4C，10000g，離心15rain，移去上清液儲(chǔ)存。
    (7)將上清分裝入數(shù)個(gè)1．5 m1的管中。在不同的管中加入免疫血清或?qū)φ昭?雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清或小鼠腹水)。其他體積要與抗體量、抗原量的特殊處理相適應(yīng)。
    (8)冰上孵育1min。
    (9)針對(duì)抗體—抗原反應(yīng)，加入蛋白A還是蛋白G微球取決于所使用的抗體類型(見(jiàn)下表)，加入100ml含有10％微球的裂解緩沖液(zui后微球體積為10 m1)，密封，4C搖床孵育1h。
    (10)10000g，15s，413，離心收集微球，用裂解緩沖液清洗免疫復(fù)合物3次，用23號(hào)針吸取裂解物和洗液。
    (11)盡可能移去zui后的洗液。
    (12)將免疫復(fù)合物進(jìn)行分析，通常采用SDS-PAGE電泳。